[DNA QC_#1] 나노드랍_Nanodrop편(DNA Purity 측정)

안녕하세요~!!

샤봉입니다.~!!!

오늘은 NGS 검사의 꽃?? 꽃이라고 할수 있나?? 암튼 말하면..입 아픈.....너무너무 중요한 과정입니다.

QC 라는 용어는 어느 직군에서도 다 사용되는 말이죠??

말 그대로 DNA의 Quality를 확인하는 작업입니다.!!

NGS QC에는 Purity와 Quantity 개념이 참으로 중요한데~~!!

Purity는 Pure하다 순수하다~~ DNA의 순도를 보는 작업인데요~!!

추출한 DNA의 Purity가 좋지 않다면~~ 여러 방해요소 흔히 inhibitor 라고 부르는 저해제들로 인해 검사가 제대로 

안되는 경우와 종종 있습니다.~!!

NGS는 검사 비용이 비싸다 보니깐... QC를 민감하게 봅니다~!! 실수는 곧,,,,큰....비용 지출로 이어지거든요~!!

Quantity는 DNA의 양을 측정하는 것입니다.

검사에서 요구하는 정확한 DNA양을 넣기 위해~~!! 측량을 하는 것이지요~!!

Quantity는 다른 포스트에서 설명을 드리도록 하겠습니다.

오늘은 Purity를 측정할 때 사용하는 Nanodrop에 대해 설명 드리려고 합니다.~!!!

일단 장비의 생김새를 보시죠~~!!

출처 : 써모피셔

분자 검사실에서 일해본 경험이 있으시다면~~ 꼭 한번은 보셨을텐데요~~!!

Nanodrop 2000으로 불리우며~~지금까지도 많이 사용되고 있지요!

하지만...이 모델 단종되었다고 합니다..ㅎㅎ

요즘 최신모델은 Nanodrop ONE 이라는 제품입니다.

출저 : 써모피셔

이전 모델에 비해서 기능적인 부분은 큰 변화를 잘 모르지만... 일단 이전 모델은 모니터 컴퓨터를 따로 가지고 있어야 

하므로 부피가 컸는데, 이 모델은 올인원 제품이라~~검사실에서 부피를 적게 차지하게 됩니다~!!

아주 만족스러워요~!!^^

이야기가 딴곳으로 빠져버렸는데요...ㅎㅎ

일단 Nanodrop 장비의 원리는 Spectrophotometer 라고 하는 분광광도계 입니다~!!!

분광~! 빛을 분리하고~!! 측정하는 것이겠죠~~!!?!? 맞습니다 ㅋ

모든 물질은 고유의 흡광 파장을 지닌다고 합니다~~!!^^

그러면 우리가 알아보고 싶은건~~!!

DNA, 즉 핵산의 파장인데요~!!

핵산의 고유한 파장은 260nm 입니다.

DNA, RNA등 260nm 파장대를 흡수한다고 합니다~!^^

이런 장비들을 보면 ~~UV-VIS 뭐 이런 문구가 많은데~~ 핵산의 파장대가 자외선 UV의 영역에 있어서

분광광도계의 성능을 UV영역까지 측정이 가능하다~~ 이런식으로 홍보하는 것입니다.!!^^

DNA를 추출하고~~ DNA의 파장대만 딱 측정되면 엄청나게 순도 높은 것인데요~!!

그렇게 나올수는 없습니다.!!

그래서~~ 일정 비율의 기준을 정해두고~!! 그 안에 포함되면 Purity가 좋다고 말합니다!!

그 비율을 알기전에~~ 그러면 순도를 방해하는 요소는 무엇이고~!!

그것의 파장대는 무엇일까요??

우선 230nm !    230nm는 phenol, guanidine등의 시약에 들어있는 화학적 물질이라고 합니다~!!!

이말인 즉슨..~!!! 230nm 파장이 많이 잡혔다는 것은 DNA추출 과정에서 시약의 Wash 덜 되고~~ 마지막 Elution까지 

남아 Purity에 영향을 주는 것입니다. 이런 원리를 알아야~~ 문제해결도 가능하겠죠~??~^^

그리고 하나 더있는데요~!! 280nm입니다.

280nm는 트립토판, 타이로신 등 펩타이트?? 단백질의 주 구성원이 측정되는 파장대 입니다.

이 파장대의 비율이 높아진다는 것은~~!! 또 생각을 해보면~~ Lysis 과정 이후~ 단백질이 Wash가 잘 되지 않았거나,

Lysis가 잘되지 않거나~~~ 검체량의 과다해서 전부 Lysis되지가 않는 등 많은 이유를 생각해 볼 수 있을 것 같아요~!!

그래서 Purity를 판단할때 위의 3가지의 파장대를 비율로 구성하여, 일정 기준으로 판단을 하게됩니다.

이런 용어를 OD ratio 라고 불리기도 합니다. ㅋ 그냥 흡광도 비율,... ^^

Ratio 비율의 종류 목적 범위를 말씀드릴께요~!!

Ratio	목적	Good DNA 범위
260nm/280nm Ratio	Protein 오염도 측정	1.8 ~ 2.0
260nm/230nm Ratio	Organic Compound 오염도 측정	2.0 ~ 2.2

위의 표와 같은 기준이라고 생각하시면 될것 같아요~!!

Nanodrop은 Purity 측정 외에도 Quantity의 기능도 하는데요~!!

NGS DNA Quantity 측정에는 더 정확한 값을 위해 다른 장비를 이용하게 됩니다.!

dsDNA의 정확한 값이 필요한데 Nanodrop에서는 ssDNA가 포함되어 농도가 높게 측정되는 것으로 보여,

많은 NGS 시약 제조사의 권장사항에서도 Quantity는 다른 장비를 통해서 측정하기를 권하고 있습니다.!!^^

올바른 검사를 위해서는 DNA QC는 너무너무 중요하다고 생각이 됩니다!!^^

 

출처 : 써모피셔

 

위의 그림은 Nanodrop에서 나타나는 곡선 그래프인데요~!!

가장 이상적인 그래프입니다~!!

Nanodrop 사용하실떄 항상 저 그림처럼 나오시기를 바랍니다!!!

오늘도~~ 장문의 장황을 글을 쓴 샤봉입니다.!!

궁금한 사항은 언제나 댓글로 달아주시면 대답해 드리겠습니다!!!^^

 

오늘도 감사합니다!!